Primeiro Dia Internacional da Patologia

Será dia 5 de Novembro de 2014

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Galera do microscópio!!!

Sobre estudos de clonalidade de células T, salvo melhor juízo.

Uma tentativa de ser avaliar se determinada população T é clonal ou não é feita através da análise da “monoclonalidade” do receptor da célula T (TCR). São, basicamente, dois tipos de teste: (a) Análise por Southern blot no locus BETA do receptor da célula T (TCRß) ou PCR do locus GAMMA (TCRγ). O PCR do locus γ é atualmente o mais usado, embora questões para sua padronização ainda existam e são sede de dúvidas diagnósticas sobretudo no estudo de infiltrados de células T cutâneo.

O TCRγ possui vários segmentos que são nomeados em 4 famílias de acordo com a ordem de disposição genômica e os seus segmentos. Dentre estes segmentos, o V e J são os mais usados porque podem ser estudados com um número limitados de “primers”. Isso se deve a porções repetitivas da seqüência gênica. Outra razão para uso desse segmento é que o TCRγ se mantem na diferenciação da célula γδ para a célula com o TCR αβ. 

Escolhido o primer a ser utilizado para ampliação da seqüência através da reação em cadeia da polimerase, passa-se à escolha do método de detecção dos fragmentos ampliados pela PCR, que podem ser: (a) por gradiente de desnaturação no gel de eletroforese (DGGE), o método mais antigo; (b) por SSCP (polimorfismo de conformação single-strand - “single-strand conformation polimorfism”); (c) por análise heteroduplex (HDA); (d) por fluorescência (“fluorescente gene scaning” - GS) e pelo chamado (e) “cloning and sequency”.  Recentemente vem sendo cada vez mais usada a (e) análise de oligonucleotídeos por microchip. Ou seja, a pesquisa de clonalidade de células T também pode variar conforme a técnica utilizada para detecção dos fragmentos ampliados pela PCR. Por exemplo, o DGGE terá variações de acurácia a depender da conformação final dos ácidos nucleicos conseguida no tubo de teste, enquanto que o método GS vem sendo muito estudado e apontado como de maior especificidade para estudo dos infiltrados T cutâneos.

É importante que se entenda, portanto, que é dentro desse universo de sensibilidade / especificidade; valor preditivo positivo / valor preditivo negativo dos testes genéticos que nascem terminologias como “heterogeneidade clonal” e “pseudo-monoclonalidade” (e não dentro dos conceitos clássicos de diferenciação e proliferação celular, salvo melhor juízo). Seguem os conceitos relativos aos testes que com freqüência aparecem nos textos relacionados:

heterogeneidade clonal: Descreve a coexistência de 2 clones diferentes de células T na mesma amostra e pode refletir uma mistura de células T neoplásicas e inflamatórias (não-neoplásicas). Distinguir heterogeneidade clonal da possibilidade de múltiplas amostras do mesmo paciente mostrando clonalidades diferentes (possível num linfoma T, por ex.) pode ser importante porque tem sido proposto que a homogeneidade clonal (mesmo clone tumoral em mais de uma amostra) tem sido reputado como fator de pior prognóstico.

pseudomonoclonalidade: Processos inflamatórios (não-neoplásicos) frequentemente mostram pseudomonoclonalidade. Esta se caracteriza pela dominância de um produto amplificado pela PCR (amplicon) em uma mostra distinta. Este produto irá variar em amostras diferentes e, portanto, esse viés de análise pode ser evitado com a repetição do teste em amostras diversas.

Além das dificuldades técnicas acima indicadas, há que se considerar que alguns tipos de linfoma podem se apresentar como “armadilhas moleculares”. Tratam-se dos (a) linfomas com perda da expressão do TCR, (b) linfomas NK e (c) linfomas B rico em células T. A negatividade da pesquisa de clonalidade T pelo PCR é "negativa" nestes casos não porque não há a dita clonalidade tumoral mas porque o tumor não apresenta a molécula na qual os testes são feitos.

GATA3

GATA3

MARCADOR IMUNOISTOQUÍMICO ÚTIL PARA IDENTIFICAÇÃO DE SÍTIOS PRIMÁRIOS MAMÁRIOS E UROTELIAIS.

A proteína ligaste GATA3  é um fator de transcrição (família GATA). Sua perda alélica constitucional causa uma síndrome caracterizada por hipoparatireoidismo, surdez neurosensorial e malformações renais. Tais manifestações são abreviadamente chamadas de HDR.

O GATA3 na patologia cirúrgica tem sido utilizado como: (a) marcador de carcinomas mamários e (b) uroteliais.

Nos carcinomas mamários mostra positividade de 80% a 90% (os mais bem diferenciados mostram maior expressão e menor nos triplo-negativos (67%). O carcinoma mamário masculino mostra positividade muito menor. 

No carcinoma urotelial é útil na diferenciação entre carcinomas: (a) urotelial vs prostático; (b) urotelial vs CCE; com positividade do GATA3 (nas séries que mais o favorecem) chegando a 80%. Cuidado deve ser tomado na avaliação de espécimes prostáticos dado que o epitélio das glândulas das vesículas seminais expressa este marcador.

A imunomarcação pelo GATA3 é nuclear (clone L50-823). Seu controle interno pode ser linfócitos T, (sua função também está presente nesta população celular).

Fora do universo descrito acima, há outras possibilidade de utilização do GATA3, todas com alguma ressalva. Há alta positividade em carcinomas de células escamosas da pele e essa propriedade pode ser útil para definição entre um sítio primário cutâneo de sítios como cervical, pulmonar e laríngeo (estes com algum grau de positividade, variável segundo diversos trabalhos).

Outra utilidade interessante é para subclassificação de carcinomas renais. O subtipo que mais o expressa é o cromófobo (40%) enquanto que os demais tipos a expressão é < 2%. Entretanto, o oncocitoma, que pode ser um diagnóstico diferencial importante também o expressa. Neste caso, se por um lado não há utilidade para o diagnóstico diferencial, há, por outro lado, uma expectativa (por “razão biológica”) em ligar do ponto de vista histogenético os carcinomas cromófobos aos oncocitomas (oriundos, portanto, do néfron distal GATA3+ e não das anteriormente reputadas como origem "células intercalares dos duetos coletores"). Assim, justificam-se os caso híbridos carcinoma/oncocitoma. Alguns destes tumores híbridos estão ligados à síndrome Birt-Hogg-Dubé.

Os coriocarcinomas são GATA3+ e os tumores do seio endodérmico o marcam nos corpos de Schiller-Duval. Cerca de 80% dos paragangliomas são GATA3+ e podem ter alguma utilidade na diferenciação de carcinomas neuroendócrinos.

Linfomas foliculares Bcl2-negativos

A aplicação imunoistoquímica do anticorpo anti-Bcl2 (clone 124, o mais usado) é, na maior parte das vezes, útil e suficiente no diagnóstico do Linfoma Folicular. Sua positividade nos centros germinativos é muito contrastante com casos de hiperplasia folicular reacional que são sempre Bcl2 negativos. Entretanto, são descritos casos de Linfoma Folicular Bcl2-negativos (ao menos 10% dos casos) e o motivo da tal negatividade para o imunomarcador Bcl2 pode ser atribuído (a) à sensibilidade do clone 124; (b) a ausência do rearranjo t(14;18), característico da neoplasia.

Há clones diferentes para imunomarcadores semelhantes. Na hematoncologia é bem conhecida a baixa sensibilidade de marcadores fabricados anteriormente ao SP4 para a reação da Ciclina-D1 no diagnóstico do Linfoma do Manto. A possibilidade de falso-negativo do clone 124 no Linfoma Folicular, entretanto, é menos comentada e essa possibilidade pode ser contornada em alguns casos com a utilização complementar do clone E17. Nos casos tanto 124 e E17 negativos, o raciocínio retorna para a questão da translocação t(14;18).

O gene que codifica a proteína Bcl2 é um oncogene (logo, existe normalmente) e possui uma função anti-apoptótica (contrabalanceada pelo gene BAX, da mesma família). O Bcl2 regula negativamente a apoptose e, em sua função normal, impede que células entrem em morte programada (é normalmente negativo, portanto, em centros terminativos reacionais). Sua alteração genética ocorre justapondo o gene BCL2 ao gene que produz a cadeia pesada das imunoglobulinas (@IGH). A alteração além de resultar em hiperexpressão da proteína nas células (detectável pela imunoistoquímica), também concede vantagem proliferativa aos clones de linfócitos mutados. Nesse ponto, vale lembrar que linfomas agressivos ditos double-hit apresentam como opção de segunda alteração gênica a mutação do BLC2 e, portanto, com características antiapoptóticas além da vantagem proliferativa concedida pela primeira mutação (no locus MYC/8q24).

A translocação t(14;18) é a principal alteração relacionada à hiperexpressão do Bcl2. Entretanto, observam-se linfomas foliculares que não apresentam tal translocação e a etiopatogênese nestes casos não pode ser explicada com outros argumentos. Mais importante na prática do patologista, o diagnóstico nestes casos torna-se muito difícil e irá se balizar na morfologia dos agregados linfoides e na exclusão de outros linfomas. Vale aqui também lembrar que os linfomas foliculares primários da pele (ditos centrofoliculares) diversamente, são, na maior parte, Bcl-2 negativos e não mostram a t(14;18).

As fotos abaixam ilustram um caso de linfoma folicular do mediastino recidivado de um paciente adulto. O Bcl2 foi negativo nos dois clones testados (124 e E17) e o teste do rearranjo t(14;18) também foi negativo. O diagnóstico se baseia neste caso na morfologia: arquitetura folicular e células polimorfas (bifenotípicas: ora centroblásticas e ora centróciticas). O CD23 mostra positividade para células além daquelas normalmente positivas nos centros germinativos e também a co-expressão de CD5. O MUM1 foi positiva em subset de linfócitos (vide comentários sobre este marcador em posts posteriores).

Células polimorfas (bifenotípicas: ora centroblásticas e ora centróciticas). Como há uma predominância de centroblastos (concordam?) acho que cabe aqui a classificação 3a da OMS 2008.

CD10+ (vide o mesmo filete nervoso que é demonstrado na foto do HE com algumas células fortemente CD10+). Vejam que a reação do CD10 em linfócitos é quase sempre meio que "desmaiada"(fraca).

CD23 positivo tanto na trama do centro germinativo quanto em células fora desse contexto/localização (vide o mesmo filete nervoso que é demonstrado na foto do HE)

Detalhe de outra positividade do CD23 

 Positividade do CD5 (interessante no Linfoma Folicular - será discutida em outro post)

Positividade para Bcl6 (vide o mesmo filete nervoso que é demonstrado na foto do HE)

PS: 1- Esse caso também foi positivo (em algumas células) para o MUM.1 e tal expressão também será discutida em outro post (porque agora eu vou dormir). Abraços, Fred. 2- Não  hesitem em deixar algum comentário em casos de dúvida! 3- Se quiserem publicar alguma coisa aqui (eu ficaria feliz!) basta me mandar as fotos e o texto no meu email fhcmelo@gmail.com. Pelo menos tentem fazer alguma vez, é um ótimo exercício didático/de aprendizagem. 

Merci!

Reuião Patologia/Oncologia #156

Carcinomas neuroindocrinos

Petição Pública

Esquema de neoplasias da região da hipófise

Dr. Bernardo Ferreira de Paula Ricardo 

Dr. Bernardo Bacelar Farias 

Dr. Paulo Hernane Rabelo Azevedo

Sarcoma pleomórfico indiferenciado / inclassificável

SARCOMA PLEOMÓRFICO INDIFERENCIADO / INCLASSIFICÁVEL
Caso HC – UFMG 8659-13
Autor: Dr. Paulo Hernane Rabelo Azevedo

Produto de amputação de membro superior esquerdo apresentando, na face medial do braço, tumoração ulcerada, brancacenta, relativamente circunscrita, com áreas de necrose, que não invade pele nem osso, medindo 15 cm de maior diâmetro.

O exame histopatológico evidenciou neoplasia indiferenciada constituída por células pleomórficas e atípicas em arranjo sólido/estoriforme, algumas células multinucleadas bizarras e poucas células inflamatórias mononucleadas de permeio. O índice mitótico é alto e coexistem extensas áreas de necrose.

Segue-se o painel imunohistoquímico:
h-Caldesmon positivo.
Miogenina negativo.
CD68 negativo.
Actina (SMA) negativo.
Desmina negativo.
S100 negativo.
EMA negativo.
Ki67 positivo (40%)

CONCLUSÃO: SARCOMA PLEOMÓRFICO INDIFERENCIADO / INCLASSIFICÁVEL

DISCUSSÃO
Aqueles sarcomas que não demonstram uma linha evidente de diferenciação e não podem ser classificados e suportavam a denominação de “Histiocitoma Fibroso Maligno” (HFM) segundo a OMS 2001, hoje devem ser designados como Sarcoma Indiferenciado / Inclassificável (SII). Essa mudança trazida pela Organização Mundial da Saúda (OMS) – 2013 tenta reforçar o conceito de que este é um diagnóstico de exclusão, considerando que só após o estudo imunohistoquímico e/ou com microscopia eletrônica pode-se caracterizar com precisão o diagnóstico.

Estudos demonstraram que alguns desses tumores eram, na realidade, variantes pleomórficas de lipossarcoma, leiomiossarcoma e rabdomiossarcoma, bem como lipossarcomas desdiferenciados. Ainda assim, alguns tumores não puderam ser classificados e, desse modo, foram denominados como SII. É importante lembrar que carcinomas, melanomas e linfomas podem ter morfologia semelhante, mas com implicações terapêuticas diversas.

Esta entidade pode ser estratificada em quatro subtipos:
- Sarcoma pleomórfico inclassificável (SPI): este ainda com variações possíveis de “com células gigantes” e “com inflamação proeminente”;
Surgem em pacientes entorno de 40 anos e como tumores grandes frequentemente com áreas de necrose. São caracterizados por considerável pleomorfismo celular e células multinucleadas bizarras em arranjo estoriforme e com estroma colágeno contendo processo inflamatório de grau variável com macrófagos xantomizados.

Aqueles tumores que apresentam alguma diferenciação muscular (rabdomiossarcoma/leiomiossarcoma pleomórfico) possuem duas vezes maior chance de apresentar metástase, enquanto que os lipossarcomas desdiferenciados são relativamente indolentes.

Grande parte das neoplasias de alto grau de pleomorfismo, que até o momento não eram classificadas, são certamente de linhagem fibroblástica ou miofibroblástica. Um menor grupo, porém significante, ainda permanece um enigma e é fonte de vários estudos. Estes sim devem ser designados com SPI, já que a terminologia de HFM foi abandonada pela OMS nestes casos.

A variante com células gigantes é mais frequentemente encontrada em coxa de homens idosos e, principalmente, em tecidos superficiais. Os que surgem em tecidos mais profundos, abaixo da fáscia muscular, são mais agressivos, enquanto que os mais superficiais têm melhor prognóstico, motivo pelo qual estes últimos podem ser reclassificados como “tumor de células gigantes de partes moles”. Pelo menos 50% destes tumores possuem formação óssea e devem, portanto, ser diferenciados do osteossarcoma variante rico em células gigantes. Outros diagnósticos diferenciais são carcinomas (pulmão, pâncreas, tireoide) e, menos frequentemente, melanoma, com reação osteoclástica exuberante. Somente após exclusão de todas essas possibilidades o diagnóstico de SPI deve ser considerado.

A variante com inflamação proeminente, já designada como “HFM inflamatório”, afeta preferencialmente o retroperitônio de pacientes adultos e está associado à leucocitose circulante. É caracterizada por células grandes xantomizadas de atipia variável em meio a numerosos leucócitos polimorfonucleares sem associação com necrose, além de células pleomórficas e multinucleadas, tipo Reed-Sternbeg, em arranjo estoriforme. Sabe-se que grande partes destes tumores hoje podem ser identificados como lipossarcomas desdiferenciados. Outros tumores que podem ter esse padrão são carcinomas pouco diferenciados (pulmão e trato gastrointestinal), linfoma anaplásico de grandes células, sarcoma histiocítico, melanoma. Deve-se considerar também como diagnósticos diferenciais pielonefrite xantogranulomatosa, doença de Erdheim-Chester e outros sarcomas com grande população de células xantomizadas.

- Sarcoma fusocelular inclassificável: possuem padrão de crescimento fascicular.

Alguns desses tumores são, na realidade, fibrossarcoma ou miofibrossarcomas. Também não podem ser confundidos com a variante monomórfica do sarcoma sinovial e a variante fibrossarcomatosa (alto grau) do dermatofibrossarcoma protuberans.

- Sarcoma epitelióide inclassificável: possuem citoplasma anfofílico ou pálido e núcleo vesiculoso. O sarcoma epitelióide tipo proximal e carcinoma mioepitelial de alto grau já foram submetidos a essa categoria. A positividade para CD34 (sem outros antígenos endoteliais) favorece o diagnóstico. São geralmente agressivos.

- Sarcoma de células redondas inclassificável (SCRI): mais comum em crianças e adultos jovens e é morfologicamente semelhante ao sarcoma de Ewing, porém com mais citoplasma e acentuado pleomorfismo nuclear.

O diagnóstico diferencial com sarcoma de Ewing, rabdomiossarcoma, linfoma e neuroblastoma metastático só pode ser feito com testes genéticos moleculares. A positividade focal de membrana com alguma extensão para o citoplasma para CD99 não possuem significado diagnóstico, mas pode ser diferenciada do padrão difuso de coloração de membrana visto no sarcoma de Ewing.

Estudos genéticos sugerem que subtipos do SCRI podem ser determinados. Alguns mostraram a rara fusão gênica EWSR-1 provando ser uma variante do sarcoma de Ewing. Outros demonstraram em tumores com maior pleomorfismo celular e nucléolo mais proeminente que no sarcoma de Ewing uma entidade distinta caracterizada pela fusão gênica CIC-DUX-4. Outro subgrupo distinto identificado em ossos mostra a fusão BCOR-CCNB-3. Esses subtipos ainda são tratados como sarcoma de Ewing e suas implicações terapêuticas ainda precisam ser conhecidas.

Pérsio Godoy

Caderno avulso de anotações do Professor Pérsio Godoy.

Esquema de desenho de glomérulo